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培養上清からのエクソソーム回収と
タンパク質およびmiRNA抽出方法の基礎

培養上清からのエクソソーム回収とタンパク質およびmiRNA抽出方法の基礎

4. エクソソームからのmiRNAの抽出方法について

エクソソーム画分からのmiRNA抽出実験も行っています。エクソソーム画分に、RNaseなどを変性させるチオシアン酸グアニジンやフェノールを含む、各社から発売されているRNA抽出試薬(QIAsol [Qiagen], TRIzol [Thermo Fisher]など)を利用してのフェノール/クロロホルム抽出法で抽出しています。精製前にspike-in(内部標準となる既知濃度miRNA)としてcel-miR-39を入れるようにしています。

この抽出状態のサンプルで次世代シーケンス(NGS)解析を行っていますが、約200種類ものエクソソームのmiRNA発現量解析に成功しています。NGSのmiRNA-Seqでスクリーニングを行い、着目したmiRNAについてqPCRで個別に厳密な発現定量するという流れで解析を進めています。発現量が多いmiRNAに関しては、qPCRでの検出について特段の問題はないように感じていますが、低発現のmiRNAを追いかける場合には、データのノイズを低減させるという意味でも、シリカカラムや磁性ビーズなどのRNA精製キットで追加精製を行ったほうが良いかもしれません。このあたりの必要とされるmiRNAの精製条件については、今後精査していきたいと考えています。

もし、実験を途中で中断する場合は、こちらもmiRNA精製までは行う必要があります。miRNAサンプルは -80℃で保存が可能です。

A

B

Fig.5:精製エクソソームから抽出したmiRNAを用いたリアルタイムPCRの結果
Sample1および2におけるmiR-Aの量をリアルタイムPCRにより比較した。
A) miR-A(標的miRNA)とCelmiR-39(Spike-in control)の増幅曲線
B) 存在量比のグラフ

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